３）ステップ3
培養細胞細胞からの磁気免疫沈降
ネガティブおよびポジティブコントロールを含む実行されるIPの数を決定します。必要量のDiaMag Protein Aコーティング磁気ビーズを取り出し、清潔な1.5 mlチューブに移します。 IPあたり20μlのビーズが必要です。
5×ChIPバッファーiC1 300μlをChIP-seqグレードの水1.2 mlで希釈し、1x ChIPバッファーiC1を調製します。希釈したChIPバッファーiC1を氷上に置きます。
ビーズを320μlの氷冷1×ChIPバッファーiC1で4回洗浄します。ビーズを洗浄するには、1×ChIPバッファーiC1を加え、数回ピペッティングしてビーズを再懸濁し、チューブをDiaMag 1.5ml磁気ラック（カタログ番号B04000003）にセットします。ビーズを磁石で捕捉するために1分間待ち、上清を除去してください。これをもう3回繰り返します。
最後の洗浄後、ビーズに元のビーズ容量の（すなわち20μl）1x ChIPバッファーiC1を加えて再懸濁します。
断片化されたクロマチン1μlをインプットサンプルとしてステップ4で使用できるように分注しておいてください。
1 IPにつき、下記のようにChIP反応ミックスを調製します。免疫沈降反応数に応じた量＋小過剰（0.5反応分）を準備します：
・6μlのBSA
・1.5μlの200倍プロテアーゼ阻害剤カクテル
・56μlの5×ChIP緩衝液iC1
・100μlの断片化クロマチン
・20μlのDiaMagプロテインAコーティング磁気ビーズ
・（116.5 μl-x μl）ChIP-seqグレードの水
・ChIP-seqグレード抗体x μlを加える
x – ChIPグレード抗体の量
1 IPあたりのChIP反応混合物の総容量は300μlとします。
注意：1 IPあたりの必要な抗体量は異なります。サプライヤーによる推奨量をチェックするか、抗体の量を変えて滴定曲線を作成してください。IPの陰性対照には1μgのIgG（ネガティブコントロール抗体）を使用します。IPの陽性対照が含まれている場合は、1μgのH3K4meポジティブコントロール抗体を使用してください。必要に応じて、NaBu（終濃度20mM）または他の阻害剤を添加することができます。
DiaMag Rotatorで4℃で一晩インキュベートする。
以下のように洗浄を行ってください：チューブを軽くスピンダウンし、DiaMag 1.5ml磁気ラック（カタログ番号B04000003）にセットします。そのまま1分間待って上清を除去します。洗浄バッファーiW1 350μlを加えてください：チューブを静かに振とうしてビーズを再懸濁し、DiaMag rotator上で5分間、4℃でインキュベートします。
洗浄バッファーiW2、iW3およびiW4を用いて、それぞれ1回ずつ上記の洗浄工程を繰り返してください。
