キットを用いたクロマチン免疫沈降法プロトコール(4)


3)ステップ3
培養細胞細胞からの磁気免疫沈降

ネガティブおよびポジティブコントロールを含む実行されるIPの数を決定します。必要量のDiaMag Protein Aコーティング磁気ビーズを取り出し、清潔な1.5 mlチューブに移します。 IPあたり20μlのビーズが必要です。
   
5×ChIPバッファーiC1 300μlChIP-seqグレードの水1.2 mlで希釈し、1x ChIPバッファーiC1を調製します。希釈したChIPバッファーiC1を氷上に置きます。
   
ビーズを320μlの氷冷1×ChIPバッファーiC1で4回洗浄します。ビーズを洗浄するには、1×ChIPバッファーiC1を加え、数回ピペッティングしてビーズを再懸濁し、チューブをDiaMag 1.5ml磁気ラック(カタログ番号B04000003)にセットします。ビーズを磁石で捕捉するために1分間待ち、上清を除去してください。これをもう3回繰り返します。
   
最後の洗浄後、ビーズに元のビーズ容量の(すなわち20μl)1x ChIPバッファーiC1を加えて再懸濁します。
   
断片化されたクロマチン1μlインプットサンプルとしてステップ4で使用できるように分注しておいてください。
   
1 IPにつき、下記のようにChIP反応ミックスを調製します。免疫沈降反応数に応じた量+小過剰(0.5反応分)を準備します:

・6μlのBSA

・1.5μlの200倍プロテアーゼ阻害剤カクテル

・56μlの5×ChIP緩衝液iC1

・100μlの断片化クロマチン

・20μlのDiaMagプロテインAコーティング磁気ビーズ

・(116.5 μl-x μl)ChIP-seqグレードの水

・ChIP-seqグレード抗体x μlを加える

x – ChIPグレード抗体の量

1 IPあたりのChIP反応混合物の総容量は300μlとします。

注意:1 IPあたりの必要な抗体量は異なります。サプライヤーによる推奨量をチェックするか、抗体の量を変えて滴定曲線を作成してください。IPの陰性対照には1μgのIgG(ネガティブコントロール抗体)を使用します。IPの陽性対照が含まれている場合は、1μgのH3K4meポジティブコントロール抗体を使用してください。必要に応じて、NaBu(終濃度20mM)または他の阻害剤を添加することができます。
   
DiaMag Rotatorで4℃で一晩インキュベートする。
   
以下のように洗浄を行ってください:チューブを軽くスピンダウンし、DiaMag 1.5ml磁気ラック(カタログ番号B04000003)にセットします。そのまま1分間待って上清を除去します。洗浄バッファーiW1 350μlを加えてください:チューブを静かに振とうしてビーズを再懸濁し、DiaMag rotator上で5分間、4℃でインキュベートします。
   
洗浄バッファーiW2、iW3およびiW4を用いて、それぞれ1回ずつ上記の洗浄工程を繰り返してください。

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