ChIP-seqやChIP-qPCR等、クロマチン免疫沈降を用いた実験手法は手順が多く、経験やノウハウの積み上げが実験の成功を左右します。
DiagenodeではChIPに関する豊富な知見を基に、弊社サイエンティストによるワークショップを開催しています。
このテクニカルワークショップに寄せられた質問を中心に、皆様のChIP実験テクニックに関する質問に対する回答・アドバイスを、毎週一回、このページでご紹介していきます。
全般 (9)
Diagenodeでは全トランスクリプトーム解析とlong non-coding RNA(lncRNA)解析の受託を行っています。
また、lncRNAの研究に使用できるキットとして、D-Plex RNA-seq kitを提供しております。
NanodropはRNA、バッファーなどの不純物が定量と純度に影響する度合いが大きいため、ChIPのクロマチン収率を検証するのには適していません。
断片化クロマチンの品質管理はゲル電気泳動ないしはQubitのような蛍光ベースの定量装置をご使用ください。
また、DiaPureカラムやiPure磁性ビーズなどのDNA精製キットはChIP後のDNAやインプットサンプルの精製に適しています。これらのキットで精製したDNAは品質管理、qPCR、ChIP-seqのライブラリー調製に直接使用していただけます。
植物のサンプルで転写因子を対象としたChIPを行う場合は、植物用のDiagenode Universal Plant ChIP-seq kitをお使いください。
サンプルの断片化条件の検討にはChromatin EasyShear Kit for Plantをご利用ください。
超音波処理 (15)
Diagenodeでは最適なクロマチン調製のために様々に最適化された製品をご用意しております。
Chromatin EasyShear KitsとPicoruptorを共に使用することで、抗体が作用するエピトープに影響を与えることなく、効率的に細胞の破砕とクロマチンの断片化を行うことが可能です。
各Chromatin EasyShear Kitはサンプルや実験目的ごとに最適化された試薬と検証済みのプロトコールを提供しています。
SDS濃度についてはターゲット毎の要求に応じたワークフローに合わせて選択できます。
DiagenodeのChromatin EasyShear Kitsはクロマチン断片化実験の処理条件最適化に最適にご使用いただけます。
クロスリンク・脱クロスリンク (10)
クロマチン免疫沈降（ChIP）は細胞や組織内のタンパク質-DNA相互作用を研究する手段として一般的に使用されている実験手法です。
ChIPに使用するクロマチンを最適な状態で調製するためのカギとなるのは、クロスリンクの最適化です。
クロスリンクでは通常ホルムアルデヒドを用いてDNAとタンパク質との間に可逆的な架橋結合を形成させます。
ホルムアルデヒドは細胞膜を迅速に透過し、インタクトな細胞内で互いに近傍にあるタンパク質やDNAを素早くクロスリンクします。ホルムアルデヒドによるクロスリンクは直接相互作用する２つの分子のクロスリンクに最適です。
しかしながら、高次の相互作用や動的な相互作用に対しては、効率の高いタンパク質-タンパク質の固定化を得るためにDiagenode ChIP Cross-link Goldのような2重クロスリンクChIP固定化試薬なども考慮に入れるべきでしょう。
はい、脱クロスリンクが効率的に行われた後であればどのような精製法でも有効です。
弊社では短時間で効率よい精製が可能なiPure kit v2（ビーズベース）かDiaPure columnsをお勧めしています。
免疫沈降 (6)
必要とされる抗体の量は各抗体の特性に依存するため、常に抗体のご使用前に使用する抗体の濃度を振って最適化の実験を行うことをお勧めします。
ChIPシグナルが飽和する抗体濃度を確認してください。
また、S/N比が最適になるような抗体濃度を使用することが重要です。
www.diagenode.comでは各抗体についてウェブ上で、推奨条件とChIP-seqのバリデーション結果をご確認いただけます。
Diagenodeではバッチ毎にバリデーションされたChIP-seqグレード抗体を提供しており、それぞれについて免疫沈降用に推奨する使用量を記しています。
サンプルが特殊な場合は使用量の変更が必要な場合があります。その場合は最適化のため濃度を振り滴定を行ってください。
データ解析 (7)
解析を行う前に、ラボの担当者からデータ処理のパイプラインに何を使用したか、確認してください。論文では多くの場合何を使用したかは言及されていますが、重要なパラメータについて言及されてない場合もあるようです。
一般に、データの有効性を評価するためのいくつかのパラメータがあります。以下の観点からシーケンス品質を定量化します：
- ピークに含まれるリード数
- ピーク高さが高く、バックグラウンドが低い
- シーケンス深度
- 複雑性の高いライブラリー（重複が少ない）
- コントロールにおけるターゲットの濃縮が低い
- レプリケート間で値が相似する
- 遺伝子同士が近接する
また、ChIP-seqデータを比較するパッケージも存在しますが、注意して使用する必要があります。
典型的にはChIP-seqのバッチ効果は非常に大きく、異なるラボでのデータを比較することは簡単ではありません。実際、同じ研究室であっても昔のデータや昔のシーケンスマシンで得たデータと現在のChIP-seqのデータを単純に比較できないのです。
解析に起因するバイアスを除去するためにも、比較の際はパイプライン処理をもう一度生データから並列で実施し直すことをお勧めいたします。