ChIPテクニックQ&A

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ChIP-seqやChIP-qPCR等、クロマチン免疫沈降を用いた実験手法は手順が多く、経験やノウハウの積み上げが実験の成功を左右します。

DiagenodeではChIPに関する豊富な知見を基に、弊社サイエンティストによるワークショップを開催しています。

このテクニカルワークショップに寄せられた質問を中心に、皆様のChIP実験テクニックに関する質問に対する回答・アドバイスを、毎週一回、このページでご紹介していきます。

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全般 (3)

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ChIP-qPCRはしばしば濃縮度の低いIPサンプルに対しても分析可能な場合がありますが、ChIP-seqは大量のデータが分析の結果として生じるため、S/N比を向上させ、信頼性の高いデータを得るために濃縮度の高いIPサンプルが必要です。

そのため、ChIP-qPCRで使用した抗体の中には、ChIP-seqでは十分な濃縮度が得られず推奨できないものが含まれる場合があります。

しかしながら、一般的にChIP-qPCRでよい結果が得られている場合、ChIP-seqでも十分なシーケンス結果を得ることは可能です。

逆にChIP-seqでよい結果が得られているにもかかわらず、低品質のプライマーや未知のアニール部位のためにqPCRがうまくいかず、ChIP-qPCRの結果が良くないケースも見られますので、そのような場合はqPCRの系が機能しているか十分再検討することをお勧めします。

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Streptavidin ChIPはChIP-seqグレードの抗体がない場合に採用できる、近接依存性標識を利用した免疫沈降法です。

Streptavidin ChIPで使用する少量のフェノール・過酸化物の混入はChIPに影響を及ぼすとは考えられませんが、混入は最小限にすることが望ましいです。

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植物のサンプルで転写因子を対象としたChIPを行う場合は、植物用のDiagenode Universal Plant ChIP-seq kitをお使いください。

サンプルの断片化条件の検討にはChromatin EasyShear Kit for Plantをご利用ください。

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超音波処理 (2)

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Shearing bufferは超音波処理のなるべく直前にサンプルに添加する必要がありますが、最適な結果を得るためには、処理前に氷上で10〜15分間インキュベートします。

超音波処理は通常数分しかかかりません(超音波処理装置とサンプルタイプによって異なります)。

超音波処理時間を短くすることにより、SDSの実質的な沈殿を防ぎます。

プロセス中にSDSのごく一部が沈殿する場合であれば、これは通常害となる影響は与えません。

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サンプルホルダーに等量の水を入れたチューブをブランクとして全てのポジションに入れることをお勧めします。これは、音波の反射や干渉が処理ごとに変化するのを防ぐためです。

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クロスリンク・脱クロスリンク (3)

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はい、脱クロスリンクが効率的に行われた後であればどのような精製法でも有効です。

弊社では短時間で効率よい精製が可能なiPure kit v2(ビーズベース)かDiaPure columnsをお勧めしています。

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クロマチンを4時間、あるいはオーバーナイトで保温(65℃程度)する方法をお勧めします。

その際、Proteinase K処理が併用されることもありますが、必須ではありません。

保温の後でも、ライブラリー調製で使用される2本鎖DNAは維持されます。

ただし、ChIPmentationの手順は例外で、脱クロスリンク反応のスピードアップのため、高い温度が使用されます。

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オーバーナイトでのインキュベーションは次の日まで実験を止めておく便利なステップとして活用できますが、通常反応時間は4時間で十分です。

ただし、長時間固定化反応が行われた場合や、追加のクロスリンク試薬が使用された場合は延長されるケースもあります。とはいえ、その場合でも4時間であれば十分である可能性が高いです。

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