ChIPテクニックQ&A

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ChIP-seqやChIP-qPCR等、クロマチン免疫沈降を用いた実験手法は手順が多く、経験やノウハウの積み上げが実験の成功を左右します。

DiagenodeではChIPに関する豊富な知見を基に、弊社サイエンティストによるワークショップを開催しています。

このテクニカルワークショップに寄せられた質問を中心に、皆様のChIP実験テクニックに関する質問に対する回答・アドバイスを、毎週一回、このページでご紹介していきます。

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全般 (6)

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【FAQ】lncRNAs解析関連製品について

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Diagenodeでは全トランスクリプトーム解析とlong non-coding RNA(lncRNA)解析の受託を行っています。

また、lncRNAの研究に使用できるキットとして、D-Plex RNA-seq kitを提供しております。

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【FAQ】既知のターゲット配列が存在しない

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提案できる方法としては、目的のタンパク質のバインディングサイトを推定し、その配列を基にqPCRのプライマーをスクリーニングすることです。

この方法がうまくいかなかったとしても、シーケンシングによってChIPの確認を行うことは可能です。

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【FAQ】クロマチンDNAの精製度が上がらない

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NanodropはRNA、バッファーなどの不純物が定量と純度に影響する度合いが大きいため、ChIPのクロマチン収率を検証するのには適していません。

断片化クロマチンの品質管理はゲル電気泳動ないしはQubitのような蛍光ベースの定量装置をご使用ください。

また、DiaPureカラムiPure磁性ビーズなどのDNA精製キットはChIP後のDNAやインプットサンプルの精製に適しています。これらのキットで精製したDNAは品質管理、qPCR、ChIP-seqのライブラリー調製に直接使用していただけます。

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【FAQ】ChIPmentationで必要なサンプルの品管

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ChIPに関しては、シーケンシングを実施する前にqPCRを行うことを強くお勧めします。

また、Bioanalyzerなどでライブラリの鎖長の分布を評価してください。

ChIPを実施する際は、クロマチン断片化後、ゲル電気泳動で定期的にすべての処理後サンプルについて鎖長を評価してください。

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【FAQ】植物の転写因子用ChIPキットについて

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植物のサンプルで転写因子を対象としたChIPを行う場合は、植物用のDiagenode Universal Plant ChIP-seq kitをお使いください。

サンプルの断片化条件の検討にはChromatin EasyShear Kit for Plantをご利用ください。

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【FAQ】Streptavidin ChIPについて

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Streptavidin ChIPはChIP-seqグレードの抗体がない場合に採用できる、近接依存性標識を利用した免疫沈降法です。

Streptavidin ChIPで使用する少量のフェノール・過酸化物の混入はChIPに影響を及ぼすとは考えられませんが、混入は最小限にすることが望ましいです。

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超音波処理 (14)

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【FAQ】ソニケーションビーズの量について

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終体積2 mLのサンプルを処理する場合、15 mLのPicoruptorチューブに0.3 mLの線までソニケーションビーズを入れてください。これは約800 mgの重量となります。

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【FAQ】ソニケーションビーズの使用について

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ソニケーションビーズは特殊な用途、特殊なチューブのセットアップと組み合わせて使用していただけます。

例えばPicoruptorを用いたクロマチンの断片化を15mLチューブ中で行う場合は、ソニケーションビーズを加えて処理するのが最適です。

サンプル量が少ない場合、ビーズを入れる必要はなく、そのまま処理することで標準的な量の断片化クロマチンが得られます。

ビーズを用いたソニケーション処理は主にタンパク質やRNAの抽出に使用していただけます。

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【FAQ】結合領域の狭いタンパク質のChIPについて

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このような場合でも、200-500 bpの鎖長範囲のフラグメントがChIP-seqで最もシャープなピークを生成するため、200-500 bpの鎖長範囲を濃縮できるよう調整してください。

また、短いフラグメントはqPCRで検出されないリスクもあります。

短いフラグメントを生成するために印加するソニケーションサイクルの増加に伴い、エピトープの構造が損なわれるリスクについても考慮が必要です。

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【FAQ】ChIPでMegaruptor?

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Megaruptorで使用している技術についてはクロスリンクなどの固定化作業をしていないDNAやRNAの使用を前提にしていますので、理論的にはクロスリンクされたフラグメントにも使用可能とは考えられるものの追加で最適化が必要になると思われます。

また、ChIP実験においてもそのような大きなフラグメントの使用はバックグラウンドシグナルが高くなる恐れがあるため推奨しておりません。

参考までに、Picoruptorで安定して得られるフラグメントの鎖長範囲は100-800 bpです。その範囲内での実験もご検討ください。

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【FAQ】ソニケーション用チューブについて

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効率的なソニケーション効果を得るうえで、推奨された消耗品を使用すること、サンプルの体積を検証済みの体積として処理することは大変重要です。

チューブの形状や素材、体積を変更する場合、ソニケーションのパラメーターを変更し、改めて最適化する必要があります。

不適切な消耗品(不適切な素材)の場合、サンプルが完全に超音波エネルギーから遮断されてしまい、せん断が行われない場合があります。

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【FAQ】サンプル溶液中の泡と超音波効率

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気泡によりサンプルへの超音波エネルギーの伝達が遮断されるため、溶液が強く発泡している状態は避けることが望ましいです。

スピンダウンを行う、またはせん断バッファーの界面活性剤濃度を減らして泡が生じないように断片化作業を行ってください。

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【FAQ】ソニケーター水浴水の水温について

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実際にソニケーションを開始する前に水浴を4℃にしておくことはサンプルを保護し、最適な効率と再現性で断片化を行う上で非常に重要ですので、事前に4℃の水浴を設定し準備してください。

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【FAQ】酵素法によるクロマチン調製について

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酵素法でChIPに最適な長さのクロマチンDNAの断片長を得るためには、ヌクレアーゼ濃度と反応時間の最適化を行う必要があります。

酵素法のプロトコールは以前は頻繁に使用されていましたが、酵素の使用に起因する再現性とバイアスの問題を避けることは困難です。

確かに酵素法で得られたクロマチンDNA断片はChIPに適していますが、次世代シーケンスで網羅的に配列解読した際に、シーケンス結果にバイアスを生じる可能性があるためです。

従って、クロマチンDNAの断片化方法としては、ソニケーションをお勧めします。

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【FAQ】ChIPのバッファー調製方法について

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高品質なクロマチンの調製は複雑なプロセスを含むため、バッファー調製にも多くの最適化が必要です。

Diagenodeでは実験の最適化に役立ち、ChIP前に効率よくクロマチン調製を行っていただけるChromatin EasyShear Kitsをご用意しています。

実験対象やサンプルのタイプに応じて、バッファー組成・SDS濃度・プロトコールがクロマチン調製に最適化されています。

Chromatin EasyShear Kitsを用いたクロマチン調製の最適化法についての詳細はこちらをご覧ください。

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【FAQ】ソニケーションパターンの確認について

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同じプロセスを繰り返し行っている際でも、処理したクロマチンのバッチについて確認し、実験の前の基礎資料とすることを推奨します。

クロマチンのフラグメントサイズの検定前には必ず脱クロスリンクRNase処理を行い、DNAを精製してください。

脱クロスリンクを行わない場合、泳動速度が変化してしまうため正確なフラグメントサイズの検定は行えません。

また、RNAが残存していると低分子側にRNAがバックグラウンドとして検出されるため低分子の断片の検出に影響を及ぼします。

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【FAQ】ソニケーション前の細胞の再懸濁について

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100~300万個・細胞あたりShearing buffer 100μLが通常最適な体積です。

ただし、使用される細胞の種類によって最適な体積は変動します。

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【FAQ】クロマチンの凍結保存について

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Shearing buffer中のクロマチンは少なくとも数週間は-20℃で凍結保存することが可能です。

しかしながら、超音波処理後ただちに使用したほうが最適な結果が得られます。

また、プロテアーゼ阻害剤について、特に可溶化した細胞を扱う際はプロトコール全般にわたって使用することをお勧めします。

したがって、クロマチンの保存バッファーにもプロテアーゼ阻害剤を加えてください。

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【FAQ】ソニケーション時のサンプルホルダーについて

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サンプルホルダーに等量の水を入れたチューブをブランクとして全てのポジションに入れることをお勧めします。これは、音波の反射や干渉が処理ごとに変化するのを防ぐためです。

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【FAQ】SDSの析出を防ぐ方法について

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Shearing bufferは超音波処理のなるべく直前にサンプルに添加する必要がありますが、最適な結果を得るためには、超音波処理前に氷上で10〜15分間インキュベートします。

超音波処理は通常数分しかかかりません(超音波処理装置とサンプルタイプによって異なります)。

超音波処理時間を短くすることにより、SDSの実質的な沈殿を防ぎます。

プロセス中にSDSのごく一部が沈殿する場合であれば、これは通常害となる影響は与えません。

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クロスリンク・脱クロスリンク (8)

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【FAQ】クロスリンク(固定化)と核の単離について

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クロスリンクはDNAとタンパク質の相互作用を捕捉するために必ず最初に行ってください。

また、新鮮な細胞からの核の単離は細胞にストレスをかけ、ゲノムの部位によってはタンパク質結合部位が変わる場合があります。

したがってクロスリンクは単離前に最初に行ってください。

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【FAQ】培養液中でクロスリンク

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細胞は接着細胞の場合、培養液中で直接固定化することが可能で、あるいは一度再懸濁した細胞に対して固定化を行うこともできます。

どちらも固定化の方法として使用可能で、用途によって使い分けることができます。

もしPBSが細胞に悪影響を及ぼしている場合は培養液中での処理がより適しています。

その場合、同じクロスリンク効率を得るためにはクロスリンク時間を延長する必要があります。

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【FAQ】組織の凍結融解とChIPについて

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ChIP実験にとっては細胞が生きている必要はありません。

望ましくは実験直前に細胞が固定化(クロスリンク)され直ちにChIPに用いられることですが、すぐに実験できないときは細胞を凍結することは可能です。

固定化については、クロマチンの元の状態を反映させるためになるべく早く行ってください。

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【FAQ】転写因子クロスリンク時のヒストンIPについて

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クロスリンクを追加で実施するとヒストンのChIP-seqのバックグラウンドシグナルが増加する傾向にあります。

したがって、クロマチンサンプルを調製する際は各目的ごとに別々に調製することが望ましいです。

別々に調製するのに充分な試料が得られない場合、ヒストンのChIP-seqについては少なくとも品質の良いChIP-seqグレード抗体を用い、転写因子の実験について別に実施することによって、成功する確率を高めることができます。

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【FAQ】細胞・組織の凍結保存について

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可能な限り、サンプルの処理後得られたクロマチンをただちに使用するのが最適ですが、サンプルの凍結保存が必要な場合-20℃で数週間から数か月保存することが可能です。

組織は取得後ただちに凍らせてください。

また、細胞については固定化・可溶化後に凍結させることが可能です。

-80℃での保存は長期保存に適していますが、数週間から数か月であれば-20℃で十分です。

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【FAQ】脱クロスリンクの反応条件1

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クロマチンを4時間、あるいはオーバーナイトで保温(65℃程度)する方法をお勧めします。

その際、Proteinase K処理が併用されることもありますが、必須ではありません。

保温の後でも、ライブラリー調製で使用される2本鎖DNAは維持されます。

ただし、ChIPmentationの手順は例外で、脱クロスリンク反応のスピードアップのため、高い温度が使用されます。

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【FAQ】脱クロスリンクの反応条件2

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オーバーナイトでのインキュベーションは次の日まで実験を止めておく便利なステップとして活用できますが、通常反応時間は4時間で十分です。

ただし、長時間固定化反応が行われた場合や、追加のクロスリンク試薬が使用された場合は延長されるケースもあります。とはいえ、その場合でも4時間であれば十分である可能性が高いです。

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【FAQ】脱クロスリンク後のDNA精製について

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はい、脱クロスリンクが効率的に行われた後であればどのような精製法でも有効です。

弊社では短時間で効率よい精製が可能なiPure kit v2(ビーズベース)かDiaPure columnsをお勧めしています。

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免疫沈降 (6)

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【FAQ】ChIPサンプルをプールしてChIP-seq

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免疫沈降作業中に技術的なバイアスがかかることを考慮すると、複数のChIP免疫沈降物を同時に同じクロマチンから平行して処理することによって可能になると考えられますが、異なる実験から得られた免疫沈降物はプールすることは避けたほうが良いと思われます。

インプットサンプルは各処理に使用したクロマチンからそれぞれ調製してください。

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【FAQ】クロマチンDNAの定量法

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クロマチン調製・断片化用の初発サンプル量を例えば100万細胞/1免疫沈降と揃えてから処理することをお勧めします。

多少の増減は問題ありませんが、クロマチン調製時の初発細胞数・組織量を可能な限り揃えてください。

クロマチンの定量が必要な場合は、DNAは精製し、Qubitなどの蛍光法を使用して定量を行ってください。

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【FAQ】ChIPとウェスタンブロッティング

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ウェスタンブロッティングは使用するバッファーと反応条件がChIPとは異なるため、ChIP用抗体の検証方法としては不適当です。

可能であればChIP-seq検証済み抗体を使用してください(推奨される抗体濃度が示されています)。

また、ChIPの溶出画分などを検証し免疫沈降や洗浄効率を評価するのにウェスタンブロッティングを行うケースがありますが、通常必須ではありません。

ChIP効率の分析は、得られたDNA量をqPCRで判断するのが最も分かりやすい分析法と言えます。

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【FAQ】ChIPに使用するprotein A/Gビーズについて

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Protein AかGビーズのどちらを使用するかについては、免疫沈降に使用する抗体がどの動物種を免疫して得られたものかに依存します。

またprotein AはヒトIgGに対する結合性を有していますが、ヒト由来サンプルに使用してもChIP実験には大きな影響はないと考えられます。

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【FAQ】免疫沈降の前清澄化について

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Pre-clearingはprotein Aやprotein G磁気ビーズへの非特異的なタンパク質の吸着を防ぐ目的でいくつかのプロトコールにおいて推奨されています。

Pre-clearingはDiagenode ChIPプロトコールに従って実験を進める際は行う必要は必要ありません。

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【FAQ】ChIP時のクロマチン濃度と抗体濃度

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必要とされる抗体の量は各抗体の特性に依存するため、常に抗体のご使用前に使用する抗体の濃度を振って最適化の実験を行うことをお勧めします。

ChIPシグナルが飽和する抗体濃度を確認してください。

また、S/N比が最適になるような抗体濃度を使用することが重要です。

www.diagenode.comでは各抗体についてウェブ上で、推奨条件とChIP-seqのバリデーション結果をご確認いただけます。

Diagenodeではバッチ毎にバリデーションされたChIP-seqグレード抗体を提供しており、それぞれについて免疫沈降用に推奨する使用量を記しています。

サンプルが特殊な場合は使用量の変更が必要な場合があります。その場合は最適化のため濃度を振り滴定を行ってください。

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データ解析 (3)

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【FAQ】ChIP-seqのインプットサンプルのプール

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サンプル毎に1つのインプットを使用してシーケンスする方法が最もバイアスの少ないアプローチであるため、未知のサンプルにはこの方法を使用するべきでしょう。

しかしながら、サンプルのゲノム構造がレプリケート間で非常に近いと考えられる場合は、プロジェクトのコストを軽減する観点からインプットをプールすることも考慮できます。

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【FAQ】インプットの希釈倍率について

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多くの場合、インプットは1%濃度が最適です。

もしインプットのCt値がサンプルと比べてかなり早く立ち上がるようであれば、希釈を変更することももちろん可能です(その場合、計算時に希釈倍率を変更することをお忘れなく)。

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【FAQ】レプリケートとN数について

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マウス個体のバラツキを考慮し、複数のマウスから生物学的レプリケートを取得することを推奨します。

また、推奨するレプリケートのN数はChIP-seqで少なくとも2、ChIP-qPCRで少なくとも3です。

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ライブラリー調製 (5)

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【FAQ】Microplexライブラリー調製キット

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dsDNA 50pgから50ngの範囲で、イルミナNGSプラットフォーム用のシーケンス対応ライブラリーを調製可能です。

高速でシンプルな3ステッププロトコルを使用し、簡便にライブラリーを調製していただくことが可能です。

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【FAQ】ChIPmentationによるChIPの自動化について

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はい、ChIPmentationの最初の超音波処理による断片化ステップはChIPの場合とまったく同じですが、その後の免疫沈降ステップがライブラリー調製のステップと統合化されています。

また、ChIPmentationステップはSX-8Gのプログラムに完全に組み込まれています。SX-8Gを使って自動化されたChIPmentationキットの実験を行っていただけます。

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【FAQ】サンプル量とNGSライブラリー調製について

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少なくとも同じくらいの量のクロマチンを用いてChIPを始めることをお勧めします。

実質的に異なる量で開始する場合、ChIP時に免疫沈降の効率や特異性がサンプル量に影響を受け、最終的に無視できないバイアスを結果に生じさせる場合があるためです。

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【FAQ】植物サンプルとMicroplexキットについて

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Microplex Library Preparation kit v2は50 pgの全ての種のChIP済みDNAから次世代シーケンス用ライブラリーを調製していただけるキットです。

DiagenodeではMicroplexキットに互換性のあるChIP-seq用ChIPキットを取り扱っております。

サンプルの種類とターゲットの種類(ヒストン/転写因子)に応じて、下記キットを使用することにより、Microplexキットに使用できるクロマチンDNAを調製していただけます。

(これらのキットはマニュアルでの実験および自動ロボットによる実験に対応しています。)

従って、植物サンプル由来のサンプルには、Microplexキットに互換性のあるUniversal Plant ChIP-seq Kitをご使用ください。

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【FAQ】Bioanalyzerでのピークの出方について

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Bioanalyzerでサンプルを検定するとしばしば高分子側に2番目のピークが現れます。

この2番目のピークは通常対数スケール表示に伴うピークで、500 bp以上のX軸のデータが圧縮表示されることによって、高分子側の低くなだらかなピークが視覚的に大きなピークとして表示されます。

また、低分子量の分子と異なり、高分子量の分子のほうがシグナルを強く発するため、高分子側のピークが強調される傾向もあります。

Bioanalyzerのソフトウェアはピーク面積を分子数で表示する機能を有しており、これを使用すれば2番目のピークは通常かなり改善されます。

よって、2番目のピークは通常ライブラリー調製に影響は与えません。

また、ライブラリー調製時には低分子側の断片のほうが効率良く取り込まれるため、高分子の断片は調製中に大部分が取り込まれずに除去されます。

アガロースゲル電気泳動ではこのような断片長、およびSDS・タンパク質・共沈剤などの不純物に由来する誤検出が少ないため、DiagenodeではクロマチンDNA断片のサイズ確認にはアガロースゲル電気泳動の使用を推奨しております。

Figure 5. アガロースゲルおよびBioAnalyzerを用いた断片化クロマチンDNAのサイズ評価。
HeLa細胞をホルムアルデヒドで固定し、染色体をDiagenodeのプロトコルに従って調製した。 サンプルを、Picoruptorの30サイクルON / 30秒OFFで1.5 ml Picoruptor Microtubes with Caps(C30010016)を用いて超音波処理し、アガロースゲル(図A)、またはBioAnanlyzer、High Sens Agilent DNAキット(図B)によって測定した。 500bp以下および500bp超のフラグメント含有量を全表面積のパーセンテージとして算出した(図C)。図Dはモル濃度として計算されたフラグメント含有量を示す(BioAnalyzerトレースのみ)。

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ChIP-qPCR (2)

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【FAQ】ChIP-qPCRのアンプリコンサイズについて

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このアンプリコンのサイズはqPCRに最適なサイズ範囲からは外れますが、それでも機能する可能性はあります。

300bp未満のクロマチンフラグメントのうち、両方のプライマー配列を含み、増幅が可能な断片はごくわずかです。

小さいアンプリコンのプライマーペアを設計できない場合は、このような大きいアンプリコンが必要な場合があるかもしれません。

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【FAQ】ChIP-qPCRに使用するDNA量

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リアルタイムPCRには10~1000コピーの鋳型DNAが最適です。

これはゲノムDNAの場合は100 pg~1 μg、cDNAの場合は1 pg~100 ngのtotal RNAからの逆転写産物に相当します。

鋳型DNAが過剰の場合、不純物のレベルが高くなりPCR効率の低下につながります。

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ChIP-seq (4)

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【FAQ】ChIP-seqに必要なリード数について

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これは、目的のタンパク質によって異なります。鋭いピークを持つヒストン修飾の場合は3,000万リード(H3K4m3)、ピーク幅が広く量が多いもの(H3K27m3など)の場合、約5,000万リードが推奨されます。

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【FAQ】シーケンスのマルチプレックス化について

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シーケンシングをマルチプレックス化することにより、定量・精製後の個々の調製済ライブラリーを任意のモル比でプールし、同時に分析することができます。

プールされているライブラリは、異なる配列のバーコードを導入したインデックスプライマーを用いて調製する必要があり、インサートの平均サイズも同様である必要があります。

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【FAQ】ChIP-seqに必要なリード長とシーケンス深度

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リード長はサンプルの種類、実験目的及びシーケンスカバレッジの要件に応じて選びます。

長いリード長は、よりシーケンスのオーバーラップを生じる方向に働くためゲノムのde novoシーケンスや繰り返し領域の解読の信頼性を高めるのに大変有用です。

発現プロファイル解析や発現計数などのアプリケーションの場合、短いリード長でも十分でコスト的にも優位です。

ほとんどのChIP-seq実験ではリード長は50 bpで十分です。

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【FAQ】ChIP-qPCRとChIP-seqについて

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ChIP-qPCRはしばしば濃縮度の低いIPサンプルに対しても分析可能な場合がありますが、ChIP-seqは大量のデータが分析の結果として生じるため、S/N比を向上させ、信頼性の高いデータを得るために濃縮度の高いIPサンプルが必要です。

そのため、ChIP-qPCRで使用可能な抗体の中には、ChIP-seqで使用した時に十分な濃縮度が得られず推奨できないものが含まれる場合があります。

しかしながら、一般的にChIP-qPCRでよい結果が得られている場合、ChIP-seqでも十分なシーケンス結果を得ることは可能です。

逆にChIP-seqでよい結果が得られているにもかかわらず、低品質のプライマーや未知のアニール部位のためにqPCRがうまくいかず、ChIP-qPCRの結果が良くないケースも見られますので、そのような場合はqPCRの系が機能しているか十分再検討することをお勧めします。

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