ChIP-seqやChIP-qPCR等、クロマチン免疫沈降を用いた実験手法は手順が多く、経験やノウハウの積み上げが実験の成功を左右します。
DiagenodeではChIPに関する豊富な知見を基に、弊社サイエンティストによるワークショップを開催しています。
このテクニカルワークショップに寄せられた質問を中心に、皆様のChIP実験テクニックに関する質問に対する回答・アドバイスを、毎週一回、このページでご紹介していきます。
全般 (6)
Diagenodeでは全トランスクリプトーム解析とlong non-coding RNA(lncRNA)解析の受託を行っています。
また、lncRNAの研究に使用できるキットとして、D-Plex RNA-seq kitを提供しております。
NanodropはRNA、バッファーなどの不純物が定量と純度に影響する度合いが大きいため、ChIPのクロマチン収率を検証するのには適していません。
断片化クロマチンの品質管理はゲル電気泳動ないしはQubitのような蛍光ベースの定量装置をご使用ください。
また、DiaPureカラムやiPure磁性ビーズなどのDNA精製キットはChIP後のDNAやインプットサンプルの精製に適しています。これらのキットで精製したDNAは品質管理、qPCR、ChIP-seqのライブラリー調製に直接使用していただけます。
植物のサンプルで転写因子を対象としたChIPを行う場合は、植物用のDiagenode Universal Plant ChIP-seq kitをお使いください。
サンプルの断片化条件の検討にはChromatin EasyShear Kit for Plantをご利用ください。
超音波処理 (14)
クロスリンク・脱クロスリンク (8)
はい、脱クロスリンクが効率的に行われた後であればどのような精製法でも有効です。
弊社では短時間で効率よい精製が可能なiPure kit v2（ビーズベース）かDiaPure columnsをお勧めしています。
免疫沈降 (6)
必要とされる抗体の量は各抗体の特性に依存するため、常に抗体のご使用前に使用する抗体の濃度を振って最適化の実験を行うことをお勧めします。
ChIPシグナルが飽和する抗体濃度を確認してください。
また、S/N比が最適になるような抗体濃度を使用することが重要です。
www.diagenode.comでは各抗体についてウェブ上で、推奨条件とChIP-seqのバリデーション結果をご確認いただけます。
Diagenodeではバッチ毎にバリデーションされたChIP-seqグレード抗体を提供しており、それぞれについて免疫沈降用に推奨する使用量を記しています。
サンプルが特殊な場合は使用量の変更が必要な場合があります。その場合は最適化のため濃度を振り滴定を行ってください。
データ解析 (3)
ライブラリー調製 (5)
Microplex Library Preparation kit v2は50 pgの全ての種のChIP済みDNAから次世代シーケンス用ライブラリーを調製していただけるキットです。
DiagenodeではMicroplexキットに互換性のあるChIP-seq用ChIPキットを取り扱っております。
サンプルの種類とターゲットの種類（ヒストン／転写因子）に応じて、下記キットを使用することにより、Microplexキットに使用できるクロマチンDNAを調製していただけます。
- iDeal ChIP-seq Kit for Transcription Factors (Cat. No. C01010055)
- iDeal ChIP-seq Kit for Histones (Cat. No.C01010051)
- True MicroChIP kit (Cat. No. C01010130)
- Universal Plant ChIP-seq Kit (Cat. No. C01010152)
（これらのキットはマニュアルでの実験および自動ロボットによる実験に対応しています。）
従って、植物サンプル由来のサンプルには、Microplexキットに互換性のあるUniversal Plant ChIP-seq Kitをご使用ください。
Bioanalyzerでサンプルを検定するとしばしば高分子側に2番目のピークが現れます。
この2番目のピークは通常対数スケール表示に伴うピークで、500 bp以上のX軸のデータが圧縮表示されることによって、高分子側の低くなだらかなピークが視覚的に大きなピークとして表示されます。
また、低分子量の分子と異なり、高分子量の分子のほうがシグナルを強く発するため、高分子側のピークが強調される傾向もあります。
Bioanalyzerのソフトウェアはピーク面積を分子数で表示する機能を有しており、これを使用すれば2番目のピークは通常かなり改善されます。
よって、2番目のピークは通常ライブラリー調製に影響は与えません。
また、ライブラリー調製時には低分子側の断片のほうが効率良く取り込まれるため、高分子の断片は調製中に大部分が取り込まれずに除去されます。
アガロースゲル電気泳動ではこのような断片長、およびSDS・タンパク質・共沈剤などの不純物に由来する誤検出が少ないため、DiagenodeではクロマチンDNA断片のサイズ確認にはアガロースゲル電気泳動の使用を推奨しております。
Figure 5. アガロースゲルおよびBioAnalyzerを用いた断片化クロマチンDNAのサイズ評価。
HeLa細胞をホルムアルデヒドで固定し、染色体をDiagenodeのプロトコルに従って調製した。 サンプルを、Picoruptorの30サイクルON / 30秒OFFで1.5 ml Picoruptor Microtubes with Caps（C30010016）を用いて超音波処理し、アガロースゲル（図A）、またはBioAnanlyzer、High Sens Agilent DNAキット（図B）によって測定した。 500bp以下および500bp超のフラグメント含有量を全表面積のパーセンテージとして算出した（図C）。図Dはモル濃度として計算されたフラグメント含有量を示す（BioAnalyzerトレースのみ）。
ChIP-qPCR (2)
ChIP-seq (4)
ChIP-qPCRはしばしば濃縮度の低いIPサンプルに対しても分析可能な場合がありますが、ChIP-seqは大量のデータが分析の結果として生じるため、S/N比を向上させ、信頼性の高いデータを得るために濃縮度の高いIPサンプルが必要です。
そのため、ChIP-qPCRで使用可能な抗体の中には、ChIP-seqで使用した時に十分な濃縮度が得られず推奨できないものが含まれる場合があります。
しかしながら、一般的にChIP-qPCRでよい結果が得られている場合、ChIP-seqでも十分なシーケンス結果を得ることは可能です。
逆にChIP-seqでよい結果が得られているにもかかわらず、低品質のプライマーや未知のアニール部位のためにqPCRがうまくいかず、ChIP-qPCRの結果が良くないケースも見られますので、そのような場合はqPCRの系が機能しているか十分再検討することをお勧めします。
