ChIP実験の成功のカギは、目的の生物学的シナリオの状態を反映する断片化クロマチンの調製にあります。
高品質のクロマチンサンプルは、クロマチン断片サイズの分布が適正で、またChIPできちんと認識されるクロスリンクされたエピトープが存在しています。
完全な超音波処理のプロファイルとは、①クロマチン断片サイズの分布が均質で、②目的の断片が目的外のエピトープやDNA配列を含まず、かつ③短すぎてシグナルを示さない断片を含まない、もっとも高い特異的シグナルと低いバックグラウンドを得ることのできるプロファイルのことを指します。
ChIPアッセイのソニケーション条件
ChIP実験の超音波処理による断片化において、標準的なクロマチン断片サイズの分布というものはありませんが、通常、100-500 bpが主にChIP実験で用いられており、初めての実験にはこの分布でクロマチン断片を調製するといいでしょう。
この条件から、目的配列の結合対象（ヒストンか、非ヒストンか）やChIP後の実験用途（ChIP-qPCR, ChIP-seq）等、特定の実験条件に応じて細かく検討しなおす必要があります。
一般的に、ChIP-seqでは、ChIP-qPCRよりもより厳密なフラグメント分布が推奨されます。100-300bpであればヒストンChIP-seqに適用できます（ただし必ずしも必要ではない）が、非ヒストン（転写因子およびDNAに直接結合しないタンパク質）タンパク質が対象の場合はフラグメント分布を広げた方が適しています。最近のシーケンシング技術の進化により、100〜800bpの範囲のフラグメント分布を有するクロマチンからChIP-seq実験を行うことが一般的です。
超音波処理時間の長さは、細胞型、細胞密度、試料量、固定時間、バッファー中の界面活性剤濃度などの多くの因子に依存します。したがって、新しい実験ごとに超音波処理条件を最適化することが重要です。
最良の結果を得るには、Picoruptorを使用することをお勧めします。Picoruptorは高性能で、正確かつ均一な超音波を生成し、最適なせん断効率を実現します。1000以上の査読済みの科学論文がPicoruptorを引用しています。また、Diagenode社よりPicoruptorを用いたソニケーションの応用プロトコールも提供しておりますので、参考にしていただけます。
Picoruptorソニケーター
DiagenodeのPicoruptorは、発振した超音波の伝播経路上でチューブホルダーが回転することにより、各サンプルチューブに均一な超音波エネルギーが伝達されるため、正確で偏りのない断片化を行うことが可能になっています。
こちらもご覧ください
Picoruptor総合クロマチン断片化ガイド
Chromatin shearing optimization kit – Low SDSを用いた新鮮組織および冷凍組織からの断片化クロマチン調製の最適化検討
Chromatin shearing optimization kit (Universal Plant ChIP-seq kit)を用いた植物組織からの断片化クロマチン調製の最適化
Picoruptor専用0.1、0.65、1.5 mLサンプルチューブを用いた10-300μLクロマチンの断片化
Picoruptor専用15 mLサンプルチューブを用いた0.5-2 mLクロマチンの断片化
Picoruptor専用0.2 mLサンプルチューブを用いたクロマチン断片化の再現性検討
Picoruptorを用いたChIP脱クロスリンク後のDNAの再断片化
超音波破砕装置Picoruptorとは
Picoruptor®は、Diagenode社が開発した密閉式超音波破砕装置です。
最新技術 によりDNAやクロマチンを高精度にサイズコントロールすることが可能になり、さらに独自のシンクロ型温度制御システムを採用することで、効率良く、再現性の高い超音波破砕を行うことができます。
また、幅広い試料容量(5μl~2 ml) に対応しています。
サンプルは密閉したチューブ中に入れ、水槽内で超音波を照射する方法ですので、サンプルのクロスコンタミネーション（交差感染）を防ぎ、高い再現性を実現します。
Picoruptorは、温度やサンプルとの接触形式などが高度に制御された超音波技術であるACT(Adaptive Cavitation Technology）を使用しており、クロマチン免疫沈降（ChIP）、次世代シークエンシングのためのゲノムDNAの断片化、RNA 断片化、細胞および組織の破砕などそのほか多くの実験に使用することが可能です。
これらの特徴を持つPicoruptorは、現在市場で販売されている他の超音波破砕装置と比較して数々のメリットを有しています。
ソニケーター | ソニケーター | ウルトラソニケーター |
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|---|---|---|---|---|---|
| 幅広い応用分野 | |||||
| ランダム断片化 | |||||
| 閉鎖系でコンタミを 防ぐ | |||||
| ハイスループット | |||||
| サンプル間の再現性 高 | |||||
| スケールおよび処理 サンプル量の柔軟性 | |||||
| 消耗品が安価 | |||||
| 温和な出力で、温度調節 によりサンプルを守る | |||||
| 騒音が少ない | |||||
| NGS DNA断片化 | |||||
| クロマチン断片化 | |||||
| NGS RNA断片化 | |||||
| FFPEからのDNA抽出 | |||||
| 細胞・組織からの タンパク質抽出 （質量分析・その他 の分析用） | |||||
| タッチパネル | |||||
| 本体に複数の設定を保存 |
Picoruptorは高性能で、正確かつ均一な超音波を生成し、最適なせん断効率を実現します。多くの査読済みの科学論文がPicoruptorを引用しており、国内の研究者の論文でも引用されています。お客様の組織・細胞についても豊富な前例から超音波処理メソッドを見つけることができるかもしれません。
Diagenode製品を使用している研究者による報文リストです。
Picoruptor
TET2 Functions As A Resistance Factor Against DNA Methylation Acquisition During Epstein-Barr Virus Infection.
December 2016 ・ Oncotarget Vol: 7 Issue:49 ・ PMID: 27829228 PubMed | Full-text article | Journal title page
• Hiroe Namba-Fukuyo • Sayaka Funata • Keisuke Matsusaka • Masaki Fukuyo • Bahityar Rahmutulla • Yasunobu Mano • Masashi Fukayama • Hiroyuki Aburatani • Atsushi Kaneda
Chronic Treatment Of Non-Small-Cell Lung Cancer Cells With Gefitinib Leads To An Epigenetic Loss Of Epithelial Properties Associated With Reductions In MicroRNA-155 And -200c.
January 2017 ・ PloS one Vol: 12 Issue:2 ・ PMID: 28225782 PubMed | Full-text article | Journal title page
• Michiko Narita• Eri Shimura• Atsumi Nagasawa• Toshiki Aiuchi• Yukari Suda• Yusuke Hamada• Daigo Ikegami• Chizuru Iwasawa• Kazuhiko Arakawa• Katsuhide Igarashi• Naoko Kuzumaki• Yusuke Yoshioka• Takahiro Ochiya• Hideyuki Takeshima• Toshikazu Ushijima• Minoru Narita
Dzip3 Regulates Developmental Genes In Mouse Embryonic Stem Cells By Reorganizing 3D Chromatin Conformation.
November 2015 ・ Scientific reports Vol: 5 ・ PMID: 26568260 PubMed | Full-text article | Journal title page
• Daishi Inoue • Hitoshi Aihara • Tatsuharu Sato • Hirofumi Mizusaki • Masamichi Doiguchi • Miki Higashi • Yuko Imamura • Mitsuhiro Yoneda • Takayuki Miyanishi • Satoshi Fujii • Akihiko Okuda • Takeya Nakagawa • Takashi Ito
Dynamics And Mechanisms Of Clonal Expansion Of HIV-1-Infected Cells In A Humanized Mouse Model.
July 2017 ・ Scientific reports Vol: 7 Issue:1 ・ PMID: 28761140 PubMed | Full-text article | Journal title page
• Yorifumi Satou • Hiroo Katsuya • Asami Fukuda • Naoko Misawa • Jumpei Ito • Yoshikazu Uchiyama • Paola Miyazato • Saiful Islam • Ariberto Fassati • Anat Melamed • Charles Bangham • Yoshio Koyanagi • Kei Sato
Transcriptional Silencing Of Long Noncoding RNA GNG12-AS1 Uncouples Its Transcriptional And Product-Related Functions.
February 2016 ・ Nature communications Vol: 7 ・ PMID: 26832224 PubMed | Full-text article | Journal title page
• Lovorka Stojic• Malwina Niemczyk• Arturo Orjalo• Yoko Ito• Anna Ruijter• Santiago Uribe-Lewis• Nimesh Joseph• Stephen Weston• Suraj Menon• Duncan Odom• John Rinn• Fanni Gergely• Adele Murrell
Picoruptor