超音波処理 (49)
最適化に使用したプロトコルとDiagenodeキットのプロトコルが異なる場合、異なる緩衝液と異なる可能性のあるサンプル量に合わせて、剪断条件(例えば、サイクル数)を再び適応させる必要が生じます。
試料調製と断片化最適化のためには、弊社のChIPキットと同じ緩衝系を含むEasyShearキット(https://www.diagenode.com/en/categories/chromatin-shearing)を推奨しています。
Picoruptor消耗品リスト (https://www.diagenode.com/en/categories/bioruptor-pico-accessories) から超音波処理に適していると確認済みの消耗品を選択していただけます。
Picoruptor消耗品は、オートクレーブ処理不可（オートクレーブ処理が超音波処理特性に影響を及ぼす可能性があるため）ですが、日常的にDNAやRNAのワークフローにも使用していただくことが可能な清潔さを有しています。
組織によっては、ホモジナイズに異なるアプローチが必要な場合があります。
軟組織（肝臓など）は、ダウンス型ホモジナイザーで十分にホモジナイズできます。
それに対し、硬い組織にはビーズビーティング法などによるホモジナイズの方が適しています。
Diagenodeでは、Picoruptor 2と組み合わせて使用していただけるビーズビーティング用、500μL～2mLまでのサンプルに対応できる専用チューブをご用意しております。
https://www.diagenode.com/jp/p/15-ml-bioruptor-tubes-sonication-beads-50-rxns (Cat. No. C01020031)
SDSは細胞溶解のための膜破砕、タンパク質の可溶化、分解酵素の変性に役立ちます。
SDSを含むバッファーで直接細胞を溶解する1ステップ溶解と、非イオン性洗剤を含むバッファーで細胞膜を溶解した後、分離した核をSDSを含むバッファーで処理する2ステップ溶解が可能です。
二段階の溶解により、可溶性細胞質タンパク質の大部分を除去することができます。これにより、超音波処理の効率が向上し、バックグラウンドの減少やChIPアッセイの感度の向上が期待できます。
細胞数が少ない場合は1ステップ溶解で（詳しくはこちら：Chromatin EasyShear Kit – High SDS）、細胞数が多い場合、長時間固定化した細胞や「難しい」細胞は核分離を伴う2ステップ溶解が適しています（詳しくはこちら：Chromatin EasyShear Kit – Ultra Low SDS, Low SDS and for Plant）。
超音波処理時間の長さは、細胞の種類、細胞密度、サンプル量、固定時間、せん断バッファー中の界面活性剤の濃度などの要因によって変動します。
したがって、ゲノムサイズに応じてというよりは、新しい実験を開始するごとに常に超音波処理条件を最適化することが重要です。
新しい ChIP プロジェクトを開始するときは、30秒オン/30秒オフの超音波処理サイクルを5、10、15サイクルと振ったタイムコース実験をお勧めします。いくつかの実験条件では、2 ～ 3 サイクルの短い超音波処理時間でも満足のいくクロマチンのせん断が得られる場合があります。ベストプラクティスとして、満足のいくChIP 効率 (最高の回収率/最低のバックグラウンド) が得られる最短の超音波処理時間を選択します。ChIP 実験の効率が低下する可能性があるため、過剰な超音波処理は避けてください。
超音波処理は、新しい細胞の種類ごとに最適化する必要があります。細胞は、それぞれ超音波処理に対する耐性が異なり、一部の細胞株は、他の細胞株よりもクロマチンDNAの剪断が困難です。
「困難な」細胞を扱う場合は、2段階の細胞可溶化ステップ(核分離を含む)をお勧めします。
プローブソニケーターはPicoruptorなどが出回る前から広く使用されており、原理的に同じような断片化クロマチンを得ることができます。
しかしながら、実用的にはプローブソニケーターでは超音波の波動がプローブの先端で特に強く、サンプル液中で拡散するとともに伝播が弱くなることなどの欠点もあります。
このことにより、均一な破砕結果が得られない、局所的にサンプル温度が上昇し、そのためにサンプルのエピトープに損傷が生じる、などの事象につながります。
また、プローブソニケーターはサンプルに直接接触するためコンタミネーションリスクもあります。
Picoruptorは水浴を介してチューブ中のサンプルを処理でき、音波の伝播が均一になるよう工夫され再現性のある超音波処理が可能なためお勧めできるソニケーターです。
ChIP-seqに於いてもより再現性のある結果が得られるため、実験成功の確率も増加します。
【FAQ】サイズの大きい断片がNGSライブラリーに混入
ChIPは長い断片がより濃縮される傾向があります。
断片が長いとより多くのエピトープを持っているため、短い断片よりも高い効率で免疫沈降する傾向があります。
この影響を減らすには、効率的な超音波処理を実現して、ほとんどのフラグメントを100〜800 bpの範囲にすることが重要です。
超音波処理の効率を上げるため、クロスリンクを目的のターゲットに最適化し、超音波処理の前に核を分離することによって、超音波処理時のサンプル密度を下げることが有効です。
長い断片が優先的に免疫沈降される現象は、クロマチン量に対し抗体が飽和量になっていない可能性があるため、各免疫沈降時の抗体量に特に注意を払う必要があります。
超音波処理条件については広範な条件を検討し、最適な効率と再現性が得られる条件を推奨しておりますのでサンプルチューブに対する最適処理サンプル量についても順守されることをお勧めいたします。
従って、130 μLのサンプルはDiagenode 1.5 mLチューブをご使用ください。
チューブの素材・形状・水浴への浸漬度・サンプルの体積・バッファー組成、その他いくつかのパラメーターが断片化の処理結果に影響を及ぼします。
Picoruptor DNA断片化ガイドはこちら（グローバルサイトにリンクします）
Chromatin EasyShear Kitのご案内はこちら（グローバルサイトにリンクします）
転写因子の解析用にサンプルを処理する際、1% SDSは濃度として高すぎて転写因子の変性やクロマチンからの脱離を引き起こす可能性があります。
Diagenodeでは転写因子のChIPには通常0.2% SDSを使用しており、この濃度であれば影響が最小でかつその後の抗体とのインキュベーションにも支障がありません。
0.2% SDSバッファーは弊社のChIPキットiDeal ChIP-seq kit for TFとEasyShear kit – Low SDSにも同梱され、使用されています。
ソニケーション効率はチューブの種類とサンプルの体積に依存して変動します。
Diagenode純正0.65 mLチューブと純正1.5 mL microtubes with capsでは同等のソニケーション効率を示しますが、15 mLチューブでは同等のフラグメント分布を得る場合、より長い時間のソニケーションが必要です。
Diagenode 0.2 mLチューブは最もスループットの高い選択肢でソニケーション時間も若干短くできますが、処理できるサンプルの体積は20-100μL/tubeに限定されます。
チューブ当たりのサンプルの体積は、ソニケーション効率を保ち再現性を維持するためにも守ってください。
また、サンプルの体積の減少に従い断片化効率は上昇します。もし100μLと300μLのサンプルがあり、同じ量の音波エネルギーが印加された場合、100μLのサンプルのほうが効率よく断片化されます。
Picoruptor サンプルチューブラインアップ (pdf書類)
多くの汎用チューブは柔らかい素材で製造されており、発振音波を吸収してサンプルへのエネルギーの伝達を妨げてしまうため、超音波処理には不向きです。
ソニケーション効率はチューブの材質、チューブ壁の厚み、ソニケーション水浴中のサンプルの位置に影響されます。
Fig. 汎用チューブとダイアジェノードソニケーションチューブを用いた場合のソニケーション効率の違い
HeLa細胞をホルムアルデヒドで固定化した後、Diagenode Chromatin EasyShear Kit – Low SDS (Cat. No. C01020010)を用いてクロマチンを調製した。サンプルを1.5mL Diagenode microtubes with caps (Cat. No. C30010016)および1.5 ml Eppendorf Safe-Lock tubes中で30秒on/30秒offパターンを5, 10, 15サイクルソニケーション処理を行った。100 bpラダーをサイズマーカーとして同時に泳動した。
ChIP-MSはクロマチン関連タンパク質や転写因子/共役因子をタンパク質/タンパク質とタンパク質/DNA間で架橋し、免疫沈降した後に質量分析によって標的のタンパク質と相互作用因子を同定する手法です。
その際のソニケーション条件ですが、タンパク質を損傷しないような条件を維持する上で、サンプルの種類・量・体積に応じた個別の条件を設定する必要が常に生じます。
従って、サイクル数を振って最適なソニケーション条件をご検討ください。
また、サイクル数が多すぎるとタンパク質がクロマチンから解離する場合があります。他方で一部のタンパク質は、他のタンパク質と比べて超音波処理に耐性な場合もあります。
このため、超音波処理の検討時に、目的のタンパク質に対するWestern Blotを実施することもお勧めします。
神経膠芽腫由来ニューロスフェアからのクロマチン調製にはどのような手順が推奨されますか？これまでのところ、ChIPキット添付の可溶化バッファーを使用しても、十分に可溶化した細胞は得られませんでした。
組織または弾力性のある細胞タイプの場合、高品質のクロマチンを得るために多段階の可溶化・ホモジナイゼーションステップが重要です。可溶化・せん断バッファーの組成、サンプルの濃度、およびその他のパラメーターが、最終的なChIPのパフォーマンスに影響を与えます。
（様々な細胞由来のニューロスフェアを使用している論文を参考までご紹介します）
EHM, Oliver, et al. RBPJκ-dependent signaling is essential for long-term maintenance of neural stem cells in the adult hippocampus. Journal of Neuroscience, 2010, 30.41: 13794-13807.
https://www.jneurosci.org/content/30/41/13794.full
NARUSE, Chie, et al. Heterochromatin protein 1γ deficiency decreases histone H3K27 methylation in mouse neurosphere neuronal genes. The FASEB Journal, 2020, 34.3: 3956-3968.
https://faseb.onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1096/fj.201900139R
GALLAGHER, Denis, et al. Ankrd11 is a chromatin regulator involved in autism that is essential for neural development. Developmental cell, 2015, 32.1: 31-42.
Supplemental Materials
https://ars.els-cdn.com/content/image/1-s2.0-S1534580714007709-mmc1.pdf
まずクロマチン断片化とChIPで最適な結果を得るためには凍結させず新鮮なサンプルを用いるのがベストです。密でコンスタントな断片の分布が得られ、効率的・特異的な免疫沈降の結果が得られます。
もしサンプルの凍結が避けられないときは以下のタイミングで行ってください。
組織：処理した組織の採取直後、あるいはクロマチン断片化後
培養細胞/単離細胞：細胞のクロスリンク後、クロマチン断片化前、あるいは断片化後
以下のQ&Aもご確認ください。
Q. ChIP実験を後で行うため、クロマチンを保存したいのですが、細胞・組織サンプルはどのように保存すればよいですか？
Q. 超音波処理後のクロマチンは凍結保存できますか？凍結保存する場合、凍結前にプロテアーゼ阻害剤を加える必要はありますか？
Q. 超音波処理後のクロマチンを冷凍保存する際、液体窒素で急速冷凍したほうが良いですか？それとも-80℃に保存するだけでよいですか？
Q. 事前にクロスリンク（固定化）・冷凍した細胞をソニケーションテストに用い、実際の実験を新鮮な細胞を使用しても良いですか？冷凍した細胞と新鮮な細胞で断片化の条件は変化しますか？
Q. 細胞サンプルの凍結は-80℃が良いですか？-20℃での凍結でも大丈夫ですか？
下に挙げるケースでは、ソニケーションサイクルを多く費やす必要が生じます。
・サンプル濃度が高すぎる場合
・Picoruptorチューブが推奨品でない場合（チューブの材質が柔らかいプラスチックの場合、サンプルを超音波から保護してしまう）
・クロスリンク（固定化処理）が強すぎる（1%ホルムアミド、8～10分で通常のChIPターゲットの場合充分です）
・断片化バッファーにSDSが入っていない
・Triton-Xが断片化バッファーに含まれており、SDSの効果を打ち消している
これらの状況を解消し、改善することによって、ソニケーションサイクルを減らすことができる場合がありますのでご検討ください。
より明瞭な断片化の評価には、1.2～1.8％アガロースゲルに断片化クロマチンをロードして泳動してください。最適なクロマチン量は300 ng/laneです。濃度を100 ngから500 ngまで振って泳動することも可能です。ロード量を増やすと泳動像に影響し、真のDNA断片化状況を反映しなくなるためご注意ください。泳動像から視覚的に確認できる最小の断片化クロマチン量はおよそ60000個の細胞から得られるクロマチン量と同等です。
BioAnalyzerやTapeStationのようなマイクロ流路デバイスがNGSライブラリー調製前のDNA断片のサイズ評価に広く使用されていますが、断片化クロマチンの評価には不向きです。
例えば、アガロースゲルとBioAnalyzerの結果の間で結果の不一致が報告されていますが、これはマイクロ流路デバイスがサンプル中に含まれる残留不純物（イオン、SDS、タンパク質、DNA共沈剤など）や過剰なサンプルロード量、DNAの高次構造などに対し影響を受けやすいことに起因していると言われています。
さらに、BioAnalyzerのトレースは対数軸上にプロットされているため、高分子側のトレースが低分子のトレースと比べて小さい面積上に表示されることから、断片分布状況が視覚的に誤解されやすい点も指摘されます。
また、ピークの表示がモル数の表示である場合、低分子側に多くの分子数が分布することになり、高いピークが表示されることになります。
したがって、マイクロ流路デバイスの結果を見る場合は何を評価しているか、不純物の影響のリスクなどを考慮に入れて解釈する必要があります。
下のリンクでご紹介している質問もご覧ください。
SDSは1%までの濃度で添加することによってソニケーション効率を向上させることができます。しかしながら、添加することによりターゲットタンパク質が変性したり、高次構造を解離させるリスクも増大します。
従って、実験条件やターゲットの種類に合わせたSDSの最小濃度を決めて実験することが大事です。
他の界面活性剤はSDSのソニケーション効率向上の効果を打ち消す場合があるため、可溶化バッファーやソニケーションバッファーの組成にはバランスを考慮する必要があります。
ダイアジェノードのEasyShear kitやChIP kitでは、ChIPのターゲットに応じて、SDS量を最適化したバッファーを使用していただけます。
- – <0.1% SDS：ヒストンのChIP用
- – 0.2% SDS：転写因子のChIP用
- – <0.5% SDS：植物のChIP用
- – 1% SDS：低インプットのChIP用 (ワンステップ可溶化、収率極大化)
また、SDSの濃度を変えた場合の検証済みの断片化プロトコールについてもご用意しています。詳しくは下のURLをご覧ください。
https://www.diagenode.com/jp/categories/chromatin-shearing（グローバルサイトにリンクします）
ChIPに使用する断片化クロマチンの調製には新鮮な細胞をサンプルとしてソニケーションを行い、実験に即使用するのが最も適しています。
しかしながら、凍結細胞をソニケーションして断片化することも可能です。
冷凍した細胞ペレットは、冷凍したソニケーション済みクロマチンサンプルより安定に保存できます（新鮮細胞＞冷凍細胞≫冷凍クロマチン）。
冷凍細胞は新鮮細胞とは異なる挙動を示す場合があるため、それぞれ個別にソニケーション条件を最適化することを推奨します。
最適な結果を得るために、ダイアジェノードでは冷凍した細胞より新鮮細胞を使用することを強くお勧めしています。
SDSの添加により、ソニケーション効率を向上し、クロマチンの収率、エピトープの保存性も高めることができます。
しかしながら、SDS濃度が高いとDNAに直接結合しないタンパク質同士の相互作用を損なう可能性や、変性に弱いエピトープを失って抗体結合に影響を与える可能性が生じます。
SDS濃度については実験のターゲット毎に必要性を検討し、量を調整することが必要です。
下のリンクでご紹介している質問もご覧ください。
Diagenodeでは最適なクロマチン調製のために様々に最適化された製品をご用意しております。
Chromatin EasyShear KitsとPicoruptorを共に使用することで、抗体が作用するエピトープに影響を与えることなく、効率的に細胞の破砕とクロマチンの断片化を行うことが可能です。
各Chromatin EasyShear Kitはサンプルや実験目的ごとに最適化された試薬と検証済みのプロトコールを提供しています。
SDS濃度についてはターゲット毎の要求に応じたワークフローに合わせて選択できます。
DiagenodeのChromatin EasyShear Kitsはクロマチン断片化実験の処理条件最適化に最適にご使用いただけます。
【FAQ】ChIPでMegaruptor?
Megaruptorで使用している技術についてはクロスリンクなどの固定化作業をしていないDNAやRNAの使用を前提にしていますので、理論的にはクロスリンクされたフラグメントにも使用可能とは考えられるものの追加で最適化が必要になると思われます。
また、ChIP実験においてもそのような大きなフラグメントの使用はバックグラウンドシグナルが高くなる恐れがあるため推奨しておりません。
参考までに、Picoruptorで安定して得られるフラグメントの鎖長範囲は100-800 bpです。その範囲内での実験もご検討ください。
高品質なクロマチンの調製は複雑なプロセスを含むため、バッファー調製にも多くの最適化が必要です。
Diagenodeでは実験の最適化に役立ち、ChIP前に効率よくクロマチン調製を行っていただけるChromatin EasyShear Kitsをご用意しています。
実験対象やサンプルのタイプに応じて、バッファー組成・SDS濃度・プロトコールがクロマチン調製に最適化されています。
Chromatin EasyShear Kitsを用いたクロマチン調製の最適化法についての詳細はこちらをご覧ください。
必要な超音波処理（ソニケーション）のサイクル数とトータルの超音波処理（ソニケーション）時間は必要とするDNA断片の長さによって異なります。推奨プロトコールを以下にご提供します。
実際のソニケーション結果は細胞の種類と初発サンプル量、純度、体積、濃度及びサンプルの粘性に応じて変動します。
1サイクルあたり30秒ON/30秒OFFとし、ご使用になるサンプルに対しサイクル数のタイムコースを取って最適なせん断条件の評価を行うことを推奨します。
Chromatin shearing optimization kit – Low SDSを用いた新鮮組織および冷凍組織からの断片化クロマチン調製の最適化検討
Chromatin shearing optimization kit (Universal Plant ChIP-seq kit)を用いた植物組織からの断片化クロマチン調製の最適化
Picoruptor専用0.1、0.65、1.5 mLサンプルチューブを用いた10-300μLクロマチンの断片化
Picoruptor専用15 mLサンプルチューブを用いた0.5-2 mLクロマチンの断片化
Picoruptor専用0.2 mLサンプルチューブを用いたクロマチン断片化の再現性検討
Picoruptorを用いたChIP脱クロスリンク後のDNAの再断片化
