ライブラリー調製 (15)
ATAC-Seqプロファイルは一般にヌクレオソームのラダーのように見えるため、CUT&Tag実験では適切な陽性コントロールを用いて識別できるようにすることが有用です。
ポジティブコントロールとしては、シグナルがATAC-seqシグナルと被りにくいH3K27me3が特に適しています。H3K4はATAC-seqシグナルに類似しているため、避けたほうが良いでしょう。
また、CUT&Tagでは、pA-Tn5活性を厳密に制御することによって、ATAC-seqシグナルが問題となることを回避できます。
洗浄によって非結合型の酵素を反応溶液から除去した上で、Mg2+を添加して抗体結合型pA-Tn5の活性化を行うことが可能なため、ATAC-seqシグナルを最小化することが可能です。
また、ATAC-seq Signalと反相関するH3K27me3陽性対照(および対照プライマー)をコントロール実験として含めることで、ATAC由来の異常なシグナルを検出することが可能です。
DiagenodeのIPure kitは、磁気ビーズを使用したDNA精製キットであり、ChIP、MedIP、およびCUT＆TagからDNAを抽出するために特別に最適化されています。
磁気ビーズを使用すると、DNAのみを選択的に分離できるため、DNA精製の再現性が向上します。
このシンプルなプロトコルは、あらゆるダウンストリームアプリケーション（次世代シーケンシングなど）に対応できる精製度の高いDNAを提供します。
フェノール-クロロホルム抽出と比較すると、IPureテクノロジーには、毒性がなく、複数のサンプルで実行するのがはるかに簡単であるという利点があります。
DNAは>25μlで溶出できますので、Ideal ChIP-seq kitなどに最も適切に使用していただけます。
DiagenodeのMicroChIP DiaPureカラムは、非常に少量のDNAの精製と溶出に最適化されています。
プロトコールは、低インプットChIP（True MicroChIPキットを使用するなど）やCUT＆Tag（DiagenodeのpA-Tn5を使用するアプリケーション）などの様々なエピジェネティクス実験アプリケーションで検証されていますが、他の多くのアプリケーションとも互換性があります。
DNAは、6μlまでの高濃度で溶出でき、あらゆる下流アプリケーション（NGSなど）に適しています。
Microplex Library Preparation kit v2は50 pgの全ての種のChIP済みDNAから次世代シーケンス用ライブラリーを調製していただけるキットです。
DiagenodeではMicroplexキットに互換性のあるChIP-seq用ChIPキットを取り扱っております。
サンプルの種類とターゲットの種類（ヒストン／転写因子）に応じて、下記キットを使用することにより、Microplexキットに使用できるクロマチンDNAを調製していただけます。
- iDeal ChIP-seq Kit for Transcription Factors (Cat. No. C01010055)
- iDeal ChIP-seq Kit for Histones (Cat. No.C01010051)
- True MicroChIP kit (Cat. No. C01010130)
- Universal Plant ChIP-seq Kit (Cat. No. C01010152)
（これらのキットはマニュアルでの実験および自動ロボットによる実験に対応しています。）
従って、植物サンプル由来のサンプルには、Microplexキットに互換性のあるUniversal Plant ChIP-seq Kitをご使用ください。
BioAnalyzerでサンプルを検定するとしばしば高分子側に2番目のピークが現れます。
この2番目のピークは通常対数スケール表示に伴うピークで、500 bp以上のX軸のデータが圧縮表示されることによって、高分子側の低くなだらかなピークが視覚的に大きなピークとして表示されます。
また、低分子量の分子と異なり、高分子量の分子のほうがシグナルを強く発するため、高分子側のピークが強調される傾向もあります。
BioAnalyzerのソフトウェアはピーク面積を分子数で表示する機能を有しており、これを使用すれば2番目のピークは通常かなり改善されます。
よって、2番目のピークは通常ライブラリー調製に影響は与えません。
また、ライブラリー調製時には低分子側の断片のほうが効率良く取り込まれるため、高分子の断片は調製中に大部分が取り込まれずに除去されます。
アガロースゲル電気泳動ではこのような断片長、およびSDS・タンパク質・共沈剤などの不純物に由来する誤検出が少ないため、DiagenodeではクロマチンDNA断片のサイズ確認にはアガロースゲル電気泳動の使用を推奨しております。
Figure 5. アガロースゲルおよびBioAnalyzerを用いた断片化クロマチンDNAのサイズ評価。
HeLa細胞をホルムアルデヒドで固定し、染色体をDiagenodeのプロトコルに従って調製した。 サンプルを、Picoruptorの30サイクルON / 30秒OFFで1.5 ml Picoruptor Microtubes with Caps（C30010016）を用いて超音波処理し、アガロースゲル（図A）、またはBioAnanlyzer、High Sens Agilent DNAキット（図B）によって測定した。 500bp以下および500bp超のフラグメント含有量を全表面積のパーセンテージとして算出した（図C）。図Dはモル濃度として計算されたフラグメント含有量を示す（BioAnalyzerトレースのみ）。
