RRBS (9)
Premium RRBS kitでは、メチル化および非メチル化のスパイクインコントロールを使用して、バイサルファイト変換の効率を監視できます。
コントロールのメチル化状態は既知であるため、変換率の評価に使用できます。メチル化コントロールをシーケンスした場合、変換率が100%であればすべてのリードはメチル化されたリファレンスシーケンスにのみアラインします。
お客様が標的遺伝子をすでに有している場合、DNAメチル化解析を行う最も良い方法は、Targeted DNA Methylation解析です。
しかし、ターゲットを絞らずゲノムワイドに研究を展開することで、目的遺伝子に関連する制御ネットワーク全体をより深く理解することも可能です。
例えばbsmapのようなサードパーティのソフトウェアを使って、ピークを見ることが可能です。リードのアライメントが完了すると、塩基のメチル化レベルを抽出できます。多くのアラインメントソフトにはメチル化抽出モジュールが組み込まれており、一般的なメチル化統計とともにメチル化レベルのアウトプットが得られます。
このアウトプットから、DMRの同定、アノテーション、可視化など、下流の解析が容易に行えます。
Premium RRBS kit V2のプロトコールは、25 ngから100 ngの範囲の初発gDNA量で検証されています。
従って、それよりも初発サンプル量を低くする場合、プロトコールが検証されていないため、実験の成功を保証することはできず、お勧めできません。
ヒトサンプルで正しいシーケンス深度を得るために、Illumina HiSeq 2000/2500プラットフォームではレーンあたり6サンプル、またはHiSeq 3000/4000ではレーンあたり8サンプルをシーケンスすることをお勧めします。
他の種については、ゲノムサイズとゲノム上の読み取りのマッピング効率に基づいて、何重のマルチプレックスを実施するか推定する必要があります。
Diagenode は最大 48 個のバーコードを提供するため、非常に小さなゲノムを持つ種に取り組む場合であれば最大 48 個のサンプルをまとめてプールできます。
また、ヒトサンプルの場合は、48個のサンプルをプールして複数のフローセルに分配して分析することで対応します。
