iDeal ChIP-seq kit for Histonesを用いたChIPアッセイ
１．はじめに
クロマチン免疫沈降（ChIP）は、インタクトな細胞の特定のゲノム領域とのタンパク質の会合を分析する技術です。ChIPは、エピジェネティックシグネチャーの変化、クロマチンリモデリング、および特定のゲノム領域への転写調節因子の結合状況を研究するための汎用性の高い強力な実験手法です。
多くの方は、市販されているChIPキットよりも、研究室で構築されたChIPプロトコールの方が、コストパフォーマンスが優れていると感じておられると思います。しかし、DiagenodeのChIPキットには、ラボのプロトコールでは得られない、いくつかのメリットがあります。DiagenodeのChIPキットは、サンプルの種類、インプット量、抗体の種類などの様々なパラメーター条件で慎重に検証されているため、高品質なデータを得ることができます。さらに、ChIP実験で使用するコントロールプライマーや抗体など、必要となるすべてのコンポーネントを含むキットを使用することで、バッファーや希釈液の調製に時間を費やしたり、必要な試薬を個々に購入する必要がなくなり、時間を有効利用できます。
本プロトコールでは、初めてChIPアッセイを行う人のため、またキットを用いたChIPアッセイについて使用感を想像していただくため、ChIPキットを用いたChIPアッセイの実験手順を説明いたします。
２．Diagenode iDeal ChIP-seq Kit for Histonesを用いたChIPアッセイの流れ
実験手順の概要と所要時間を下に示します。
３．準備するもの
１）装置
・セルカウンターシステム
・Picoruptor（Diagenode、カタログ番号B01060010）および1.5 ml Picoruptor Microtubes with Caps（カタログ番号C30010016）
・1.5 ml、15 mlおよび50 mlチューブ用の冷却遠心分離機
・DiaMag rotator（回転ホイール）（Diagenode、カタログ番号B05000001）
・DiaMag 1.5ml磁気ラック（Diagenode、カタログ番号B04000003）
・ボルテックスミキサー
・サーモミキサー
・Qubit®蛍光光度計（ThermoFisher Scientific）
・qPCR用サーマルサイクラー
２）試薬
・iDeal ChIP-seq Kit for Histones（Diagenode、カタログ番号C01010051, 24 rxns）
キットに含まれる材料・試薬
| 内容物 | 内容量（×10） | 保管温度 |
|---|---|---|
| プロテアーゼインヒビターカクテル | 35μl | -20℃ |
| 5% BSA (DNA free) | 60μl | -20℃ |
| ウサギIgG | 8μg | -20℃ |
| ChIP-seqグレード抗H3K4me3抗体 | 8μg | -20℃ |
| ChIP-seqグレードGAPDH TSSプライマーペア | 42μl | -20℃ |
| ChIP-seqグレードMyoglobin exon 2プライマーペア | 42μl | -20℃ |
| キャリアー | 28μl | -20℃ |
| グリシン | 200μl | 4℃ |
| 断片化バッファー iS1 | 3.6 ml | 4℃ |
| DiaMag protein A結合磁性ビーズ | 200μl | 4℃凍結厳禁 |
| 洗浄バッファー iW1 | 3.5 ml | 4℃ |
| 洗浄バッファー iW2 | 3.5 ml | 4℃ |
| 洗浄バッファー iW3 | 3.5 ml | 4℃ |
| 洗浄バッファー iW4 | 3.5 ml | 4℃ |
| ChIP-seqグレード水 | 3 ml | 4℃ |
| 溶出バッファー iE2 | 64μl | 4℃ |
| 可溶化バッファー iL1 | 20 ml | 4℃ |
| 可溶化バッファー iL2 | 20 ml | 4℃ |
| 洗浄バッファー1 イソプロパノール不含 | 700μl | 4℃ |
| 洗浄バッファー2 イソプロパノール不含 | 700μl | 4℃ |
| Cバッファー | 700μl | 4℃ |
| IPureビーズv2 | 140μl | 4℃凍結厳禁 |
| 溶出バッファー iE1 | 1.5 ml | 4℃ |
| 5×ChIPバッファー iC1 | 950μl | 4℃ |
・手袋（すべてのステップで着用）
・RNase / DNaseフリーの1.5 mlチューブと15 mlチューブ
・ホルムアルデヒド、37％、分子グレード
・リン酸緩衝生理食塩水（PBS）
・トリプシン-EDTA
・細胞培養培地
・qPCR SYBR® Green Mastermix
・ChIP-seqグレード抗体 – www.diagenode.com
・DNA濃度測定のための蛍光ベースのアッセイ、例えば Qubit高感度アッセイ（Life Technologies＃Q32851）
３）オプションの消耗品
・Chromatin Shearing Optimization kit – Low SDS（iDeal Kit for Histones）（カタログ番号C01020010）
・1M酪酸ナトリウム（NaBu）（Diagenode、カタログ番号C12020010）
・RNaseカクテル（例えばAmbion、AM2286A）、クロマチン断片の泳動時に必要
・MicroPlex Library Preparation™キットv2（Diagenode、カタログ番号C05010012、カタログ番号C05010013、カタログ番号C05010014）または
・iDeal Library Preparation Kit x24（インデックスプライマーセット1を含む）（Diagenode、カタログ番号C05010020）
