次世代シーケンサーによるsmall noncoding RNAの配列決定

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Small noncoding RNAとは

スモールノンコーディングRNA(small ncRNAs)はmiRNAやそのほかの非翻訳RNAを含む一連のRNAで、遺伝子の翻訳後発現調節に関わっていると言われています。

中でもマイクロRNA(miRNAs)は哺乳動物における重要な遺伝子発現調節分子の一つで、また多くの研究から生検検体や血しょうから抽出されたmiRNAが疾患診断・治療のバイオマーカーとして有用であることが明らかになっています。

次世代シーケンサーによる配列決定は、既存のプライマー・プローブが必要なアレイ法やqPCR法と比較して、バイオマーカーとなるmiRNAの探索において非常に高い有用性を示しています。

次世代シーケンス法の課題

近年次世代シーケンスのコストが下がり、small ncRNAの配列決定に多く使用されていますが、次世代シーケンスによる配列決定結果とマイクロアレイ・qPCR・ノーザンの結果が一致しないケースが指摘されています。

その原因の一つとして指摘されているのが、ライブラリー調製時にRNA断片両端にアダプターを結合する際のライゲーションバイアスと、ライブラリー増幅時のPCRバイアスです。特に、アダプターライゲーションに用いられるRNAリガーゼは、ターゲットの配列や高次構造に依存してコンカテマーや環化が生じるなど、最終生成物量にバイアスが生じることが報告されています。

また、ライブラリーをPCR増幅する際にもテンプレート配列の増幅効率の差によってバイアスが生じます。

これらの課題を解決しつつ、多サンプル処理を可能とするsmall ncRNAのシーケンスライブラリーの調製のため、アダプターの導入法の工夫や最適化、識別配列の導入などが現在盛んに行われています。

D-Plex small RNA-seq kit

D-Plex small RNA-seq kitはDiagenode最新のテクノロジーを用いたライゲーションフリーのsmall RNA用RNA-seqライブラリー調製キットです。

最小10 pgのsmall RNAまたは100 pgのtotal RNAといった非常に少量のサンプルから弊社のテンプレートスイッチング技術とUMI (Unique Molecular Identifier)を用い、ライゲーションバイアスとPCRバイアスの少ない安定した結果が得られる2本鎖DNAライブラリーを調製することが可能です。

所要時間1日、ワンチューブの簡便なプロトコールで、複雑性の高いライブラリーを調製できます。

サンプルから抽出されたtotal RNAや、リキッドバイオプシーから精製された循環成分を反映するsmall RNA画分からのライブラリー調製に最適にご使用いただけます。

D-Plexのメリット

  • 高い正確性

    ライゲーションフリープロトコールとUMI (Unique Molecular Identifier)により、バイアスの少ない真のデータを反映

  • バイオインフォマティクス

    高品質なデータが得られるよう、UMIなどの処理に最適化されたバイオインフォマティクスのパイプラインを用意

  • 簡便性

    ワンチューブ内で操作が完結、操作は一日で完了

  • 低インプット量

    10 pgのスモールRNAまたは100 pgのトータルRNAから調製可能

  • 臨床サンプル

    生体試料(リキッドバイオプシーなど)から得られたRNAからの解析が可能なことを検証済

small RNAsをターゲット

本キットはライゲーションを行うことなく、高い収率であらゆるsmall RNAを網羅的に含む結果が得られるD-Plexテクノロジーを用いており、広範なncRNAの研究に最適です。

複雑性の高いライブラリー

図:Ensembl Non-coding Biotype: 分子種の相対分布

ライブラリーに組み込まれた各転写産物への固有の分子識別子(Unique Molecular Identifier, UMI)の導入により、PCRによる重複リードをリードセットから除外できるようになりました。アダプターライゲーションバイアスやPCRバイアスの少ない、多様な分子種を含む結果がシングルチューブで得られます。

頑健なテクノロジー

図:2種類のサンプルとD-Plex small RNA-seq kitを使用した各ライブラリーの相関図

出発RNA量を10 ngから最小10 pgにスケールダウンした場合でも、RNA量に関わらず外れ値の少ない安定した結果が得られます。

バイオインフォマティクスツール

D-Plex small RNA-seq kitで作成したライブラリーの解析は一般的に使用されるツールの他、UMI重複除去ツールを用いて処理できます。

また、DiagenodeとKellerらのコラボレーションにより、解析で得られた配列から新規miRNAの予測や既存miRNA、ncRNAの発現量計数を行うオンラインツール「miRMaster」を使用して得られたデータを最大限に活用していただけます。

多様なバージョン

広く用いられているIllumina社の次世代シーケンサーの他、DNB (DNA nano-ball)技術を用いたMGI社製シーケンサーに対応した製品D-Plex small RNA DNBSEQ™ kitもご用意しております。

製品紹介

D-Plex small RNA-seq kit

D-Plex small RNA-seq kitはスモールノンコーディングトランスクリプトームを解析するためにデザインされたライブラリー調製キットです。

D-Plex 24 Single Indexes for Illumina - Set A

D-Plex small RNA-seq kitを用いて多検体のマルチプレックス化を行う際に使用するシングルインデックスです。Illumina社製シーケンサーでシーケンスをマルチプレックス化する際に使用していただけます。

D-Plex 24 Single Indexes for Illumina - Set B

D-Plex small RNA-seq kitを用いて多検体のマルチプレックス化を行う際に使用するシングルインデックスです。Set AとSet B合わせて最大48サンプルまでのマルチプレックス化を行うことが可能です。

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