クロスリンク・脱クロスリンク (24)
ホルムアルデヒドの品質と濃度は常に再現性があることが重要です。
市販のホルムアルデヒドの未開封瓶(一般的に37%のストック)を使用する以外では、パラホルムアルデヒドから調製する方法も可能です。
もし溶液が開封・調製後長時間保管されている場合、ホルムアルデヒドがメタノールに変化して固定化能が増強されるため、再現性が低くなります。
この結果ChIP下流の手順も影響されるため、全体的にリスクを増やすことになりますので、常に開封・調製後のホルムアルデヒドは速やかに使用してください。
別の選択肢としては、市販のホルムアルデヒドアンプル(それぞれ1mlまたは10ml)もありますので、固定化条件を厳密にそろえる場合は利用することも可能です。
Tn5はクロスリンク処理した核に効率よく入ることが可能です。従って、ホルムアルデヒドによってクロスリンク処理した核はCUT&Tagに適合します。また、転写因子のCUT&Tagには光クロスリンクを推奨します。
しかし、Tn5は、天然のクロマチンと比較して、架橋したクロマチンを断片化する効率が低い傾向があるようです。
実際は対象となる標的ごとに直接比較する必要がありますが、中程度に架橋されたクロマチン（典型的なChIP-seq/ChIPmentation試料）または二重架橋されたクロマチン（間接架橋剤を用いた転写因子などのChIP試料）であればTn5はよく機能しています。しかしクロマチンが高度に凝縮・架橋されたFFPEサンプルでは、Tn5の効率が低く、感度向上の処理などが必要な可能性が高いと思われます。
DNA結合タンパク質を研究するにあたってはタンパク質に応じてそれぞれ最適な固定化方法を使用する必要があります。また一部のエピジェネティックマークは、他のマークよりも挙動を捕捉しにくい場合があります。
従って、タンパク質-DNAの固定化が分子間の結合としてきちんと行われたかの確認を行うことは難しいですが、以下のポイントに従った実施を確認することにより、良好なクロスリンク形成の条件に近づけることは可能です。
親和性の弱いまたは希少なタンパク質-DNA結合イベントを研究する場合、固定化は培地にクロスリンク剤を加え迅速かつ直接行います。ヒストン修飾を研究する場合、固定前にトリプシン処理によって細胞を懸濁液中に懸濁してください。一般に、標準的なホルムアルデヒドを用いた1ステップのクロスリンクプロトコールを使用すると、ヒストン修飾では短い固定化時間(8 ～ 10 分)、転写因子ではそれより長い固定化時間(10 ～ 20 分)が必要です。
クロスリンク剤のホルムアルデヒドについては新鮮なものを常に使用してください。メタノールを含まない試薬の使用は必須ではありませんが、高品質で新鮮なホルムアルデヒドの使用が重要です。ホルムアルデヒドをストックしている場合は、毎月在庫をフレッシュなものと交換することにより、ChIP 実験間の高いアッセイ間再現性が確保できます。
細胞株や目的のエピトープについて、最適な固定時間を経験的に決定するために、固定化のタイムコースを常に取得してください。細胞株とエピトープは、クロスリンク効率と試薬に対する感度が大きく異なります。固定時間と温度を正確に指定してください。
ホルムアルデヒドによるクロスリンクは、時間と温度に依存するプロセスです。より高い温度とより長い持続時間で、より強い架橋が達成されます。特定のターゲットと細胞の種類に応じて室温または37℃、5分または15分などで実施できますが、実施の際は温度と時間が一定であることを確認してください。
固定化は観察対象のタンパク質をクロマチンにクロスリンクすることにより、タンパク質のクロマチンとの相互作用の強弱を測定するために使用されます。
固定化は、目的のタンパク質とクロマチンとの結合状態に変化が生じないよう、ホモジナイズする前、すなわち実験の最初に行います。
固定化（クロスリンク）の最適化時に検討すべき項目は、クロスリンク剤に何を使用するか（ホルムアルデヒドが最もポピュラー）、ホルムアルデヒドの含量％、固定化時間、温度、クロスリンクの反応停止の方法です。
使用する細胞や組織サンプルの種類や対象のエピトープによって、異なる固定化条件が必要になる場合があります。
最適な結果を得るために、サンプルやChIPのターゲットエピトープに応じて、固定化条件をそれぞれ最適化することを推奨いたします。
通常どの実験に於いても、固定化なしの条件は実験上適していません。CUT&Tagの初出論文においても実験対象はヒストン修飾とCTCFでした。
また、多くの転写因子において発現量が少ない、DNAへの結合が一過性あるいは弱い、DNAやクロマチンに間接的に結合しているなどの事象が認められます。このような場合、タンパク質-DNA相互作用を検出するためにはクロマチンのクロスリンクが必須です。
更に、多くのChIPグレード抗体はクロスリンク条件でのエピトープ認識について検証されており、ネイティブのエピトープを認識しない可能性があります。
従って、ChIPをCUT&Tagにスイッチする際は、抗体がネイティブな状態での目的エピトープに対し十分な特異性と感度を有しているか検証することが必要です。
CUT＆Tagで検証済みの抗体リストについて、弊社で取り扱っているものを下のURLにお示しいたしますので、是非ご覧ください。
https://www.diagenode.com/en/categories/cut-and-tag-antibodies
通常クロスリンクだけを取り上げて品質管理することは難しいと考えられます。
従って、クロスリンク剤（通常ホルムアルデヒド）について新鮮な試薬を必要十分な濃度条件で使用することが信頼できるクロスリンク（固定化）につながることを念頭に実験することをお勧めします。
クロスリンク（固定化）の反応時間は、とくにヒストン以外のタンパク質をChIPあるいは免疫沈降する際に変更することが多い値です。
クロスリンク（固定化）の強度を上げると細胞・組織の可溶化・ソニケーションに対する耐性が上昇するため、最適な固定化条件を得るためにはクロスリンクの反応時間を振ったサンプルないしはクロスリンクしないサンプルを比較対照とし、反応時間 vs シグナルの強度およびS/N比との相関を検討することをお勧めします。
まずクロマチン断片化とChIPで最適な結果を得るためには凍結させず新鮮なサンプルを用いるのがベストです。密でコンスタントな断片の分布が得られ、効率的・特異的な免疫沈降の結果が得られます。
もしサンプルの凍結が避けられないときは以下のタイミングで行ってください。
組織：処理した組織の採取直後、あるいはクロマチン断片化後
培養細胞/単離細胞：細胞のクロスリンク後、クロマチン断片化前、あるいは断片化後
以下のQ&Aもご確認ください。
Q. ChIP実験を後で行うため、クロマチンを保存したいのですが、細胞・組織サンプルはどのように保存すればよいですか？
Q. 超音波処理後のクロマチンは凍結保存できますか？凍結保存する場合、凍結前にプロテアーゼ阻害剤を加える必要はありますか？
Q. 超音波処理後のクロマチンを冷凍保存する際、液体窒素で急速冷凍したほうが良いですか？それとも-80℃に保存するだけでよいですか？
Q. 事前にクロスリンク（固定化）・冷凍した細胞をソニケーションテストに用い、実際の実験を新鮮な細胞を使用しても良いですか？冷凍した細胞と新鮮な細胞で断片化の条件は変化しますか？
Q. 細胞サンプルの凍結は-80℃が良いですか？-20℃での凍結でも大丈夫ですか？
クロマチン免疫沈降（ChIP）は細胞や組織内のタンパク質-DNA相互作用を研究する手段として一般的に使用されている実験手法です。
ChIPに使用するクロマチンを最適な状態で調製するためのカギとなるのは、クロスリンクの最適化です。
クロスリンクでは通常ホルムアルデヒドを用いてDNAとタンパク質との間に可逆的な架橋結合を形成させます。
ホルムアルデヒドは細胞膜を迅速に透過し、インタクトな細胞内で互いに近傍にあるタンパク質やDNAを素早くクロスリンクします。ホルムアルデヒドによるクロスリンクは直接相互作用する２つの分子のクロスリンクに最適です。
しかしながら、高次の相互作用や動的な相互作用に対しては、効率の高いタンパク質-タンパク質の固定化を得るためにDiagenode ChIP Cross-link Goldのような2重クロスリンクChIP固定化試薬なども考慮に入れるべきでしょう。
ホルムアルデヒドはDNA-DNAおよびDNA-タンパク質の相互作用している分子間を効率的に架橋します。
これは全てのヒストン及び多くの転写因子にも当てはまります。
転写因子の種類によってはDNAに直接相互作用しないため、長い分子間距離の架橋やタンパク質-タンパク質間の効率的な架橋が可能な追加のクロスリンク試薬が必要な場合があります。
ChIP Cross-link Goldはこのような転写因子のクロスリンクに最適に使用していただけます。
クロマチンを4時間、あるいはオーバーナイトで保温（65℃程度）する方法をお勧めします。
その際、Proteinase K処理が併用されることもありますが、必須ではありません。
保温の後でも、ライブラリー調製で使用される2本鎖DNAは維持されます。
ただし、ChIPmentationの手順は例外で、脱クロスリンク反応のスピードアップのため、高い温度が使用されます。
はい、脱クロスリンクが効率的に行われた後であればどのような精製法でも有効です。
弊社では短時間で効率よいDNA精製が可能なiPure kit v2（ビーズベース）かDiaPure columnsをお勧めしています。
